0.   引　　言

酸性矿山废水(Acid Mine Drainage，AMD)是人类在开采和利用矿物过程中产生的一种工业废水^[1]。AMD中不但H⁺浓度很高，而且含有高浓度的硫酸盐和较多种类、毒性较强的重金属离子（如Fe²⁺、Mn²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺）^[2-4]。AMD中的污染物不仅会对排放源周围地区产生毒害作用，而且还会通过地表水和地下水输送的方式对遥远地区产生不利影响，这种不利影响会持续存在，并随着时间的推移变得更加明显。重金属会消耗水体中大量的溶解氧，且在酸性条件下，会使水体的自净效果大幅降低^[5-6]。因此，解决AMD污染问题，保护流域环境，是矿业界面临的重大挑战，受到学者的高度关注。目前，AMD常用的处理方法主要有物理法、中和法和微生物法^[7]。物理法和中和法是水处理中常用的方法，但具有处理成本高，极易造成二次污染等缺点^[6]。微生物法中的(Sulfate-Reducing Bacteria, SRB)处理法具有经济、高效、简单的特点，被广泛的应用在水处理领域。

在酸性和含有重金属的AMD环境中，SRB的生长会受到抑制^[8]，前期研究成果表明，通过固定SRB颗粒技术可以有效解决上述问题^[9]。但是在固定SRB颗粒时需要添加碳源材料，而传统的乳酸钠等有机碳源成本较高，不适宜在处理AMD时大面积应用。因此，需要寻找一种廉价的碳源材料。褐煤作为一种煤化程度最低的材料，具有开采便利、成本低、在矿区取材方便等优点^[10]。褐煤具有发达的孔隙结构，表面含有羧基、醇羟基、酚羟基等活性基团，呈负电性，对H⁺和重金属离子具有较好的亲和性，可提升AMD的pH同时去除AMD中重金属离子^[11]。此外，徐敬尧等^[12]提出球红假单胞菌可以将褐煤中的芳香类高聚物降解为低分子量类物质。褐煤分解后的小分子有机物可以为SRB提供碳源。SRB利用褐煤分解的有机质作为碳源，将SO₄ ²⁻还原为S²⁻，S²⁻与金属离子生成沉淀，从而达到修复AMD的效果^[13]。因此，褐煤协同球红假单胞菌作为固定SRB颗粒的基质材料不仅可以解决SRB的碳源问题，而且可以吸附金属离子增强SRB的活性，但是关于褐煤协同球红假单胞菌固定SRB颗粒处理AMD中金属的机理尚不明确。

试验基于微生物固定化技术，以聚乙烯醇和饱和硼酸作为主要固定剂^[14-16]。以褐煤、球红假单胞菌和SRB为主要基质材料，制备褐煤协同球红假单胞菌固定SRB颗粒（L-P-SRB）。将制备的L-P-SRB用于处理AMD中的Fe²⁺、Mn²⁺、和SO₄ ²⁻，探究了L-P-SRB对AMD的处理效果。同时，基于还原动力学及吸附动力学原理，分析了L-P-SRB对AMD中SO₄ ²⁻和Fe²⁺、Mn²⁺去除机理。冬季气温较低，微生物在低温条件下活性会受到抑制，探究了低温冷藏处理L-P-SRB对AMD的修复效果，为低温条件下矿区处理AMD提供一定的依据。

1.   试　　验

1.1   酸性矿山废水离子去除试验材料

试验使用褐煤购自山西大同，使用破碎机将褐煤进行研磨筛分，选取粒径为75 μm的褐煤备用。试验所用球红假单胞菌是购自杭州立冬公司，在范尼尔液体培养基中进行富集培养备用。试验所用SRB来自实验室保存菌种，将菌种接入改进型Starkey式培养基中进行富集培养备用。其中，试验所用Na₂SO₄、MnSO₄、FeSO₄、硼酸、聚乙烯醇、海藻酸钠、NaCl、CaCl₂等药品均为分析纯。

模拟废水是参考某煤矿实际废水水质配制而成，其中SO₄ ²⁻、Mn²⁺、Fe²⁺质量浓度分别为816、39.31、55.14 mg/L，pH为4.0。

1.2   试验方法

根据已有研究成果^[17]，可知颗粒的最佳质量配比为褐煤3%、球红假单胞菌10%，SRB 10%。将球红假单胞菌和SRB放入50 mL离心管中，以12 000 r/min离心10 min，取离心后的沉淀备用。制备凝胶后冷却备用，将1.98 g褐煤，6.6 g球红假单胞菌浓缩液和6.6 g SRB浓缩液加入到凝胶中，制备成球形的固定化颗粒，强化4 h后取出，用9 g/L生理盐水冲洗3次。将制备好的L-P-SRB等量分装，在4 ℃条件下分别冷藏0、2、4、6 d，用以模拟实际生产中一次制备多次使用的情况。颗粒在使用前12 h，加入到无机改进型Starkey式培养基溶液激活，激活后使用。

L-P-SRB对SO₄ ²⁻的还原动力学和对Fe²⁺、Mn²⁺的吸附动力学试验：将激活后的L-P-SRB按照固液比1∶10 g/mL分别投加到250 mL的1号和2号废水中，进行褐煤协同球红假单胞菌固定SRB颗粒处理AMD中Fe²⁺、Mn²⁺和SO₄ ²⁻反应动力学试验。其中，1号废水含SO₄ ²⁻、Fe²⁺质量浓度分别为816、55.14 mg/L，pH为4.0；2号废水含SO₄ ²⁻、Mn²⁺质量浓度分别为816、39.31 mg/L，pH为4.0。在35 ℃、120 r/min的恒温振荡器中进行振荡反应，每日上午十点取样进行水质检测。试验做3组平行试验，取平均值作为最终结果。基于还原动力学及吸附动力学原理，分析L-P-SRB对AMD中SO₄ ²⁻的还原动力学和对Fe²⁺、Mn²⁺的吸附动力学。

低温冷藏处理L-P-SRB对AMD中Fe²⁺、Mn²⁺的去除试验：将L-P-SRB在4 ℃条件下分别冷藏0、2、4、6 d，分批激活，分别投入1号、2号废水中，定期检测废水中Fe²⁺、Mn²⁺的质量浓度，分析低温处理L-P-SRB对AMD中Fe²⁺、Mn²⁺的去除效果。

试验结束后，取处理AMD前后的L-P-SRB进行SEM和FT-IR检测，对比分析L-P-SRB微观结构和表面官能团的变化情况，进一步揭示L-P-SRB处理AMD的反应机理。

1.3   试验仪器和水质检测方法

试验仪器：TG-328A型电子天平、PHS-3C型pH计、CT-8022型ORP计、DL-1型电子万用炉、HZ-9811K型的双速恒温振荡器、日立Z-2000火焰原子分光光度计、V-1600PC型的可见分光光度计、JSM 7200F型扫描电子显微镜、赛默飞IS5型红外光谱仪。

pH测量方法为玻璃电极法（HJ 1147—2020）；氧化还原电位（oxidation-reduction potential, ORP）值测量方法为甘汞电极法；SO₄ ²⁻测量方法为铬酸钡分光光度法（HJ/T 342—2007）；Mn²⁺、Fe²⁺测量方法为火焰原子吸收分光光度法（GB 11911—89）。

2.   试验结果与讨论

2.1   L-P-SRB对AMD中Fe²⁺、Mn²⁺的去除效果分析

将L-P-SRB添加到含Fe²⁺、Mn²⁺的废水（1号、2号废水）后，废水中pH、ORP的变化情况以及SO₄ ²⁻、Fe²⁺、Mn²⁺的去除情况如图1、图2所示。

图  1  1号、2号废水中pH和ORP的变化情况

Figure  1.  Changes of pH and ORP in No.1 and No.2 waste water

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图  2  L-P-SRB对SO₄ ²⁻、Fe²⁺、Mn²⁺的去除情况

Figure  2.  Removal of SO₄ ²⁻, Fe²⁺, Mn²⁺ by L-P-SRB

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由图1可知，0～48 h时，L-P-SRB能有效提升1号、2号废水的pH值，降低1号、2号废水的ORP值， L-P-SRB处理1号、2号废水48 h后，pH值和ORP值分别为7.69、7.76 mV和−49、−31 mV。48~144 h时，1号、2号废水体系中的pH值逐渐趋于平稳，ORP值呈上升的趋势，最终达72 mV和61 mV。由图2可知，L-P-SRB对SO₄ ²⁻、Fe²⁺、Mn²⁺的去除率均呈先增加再趋于平稳的趋势，L-P-SRB对1号、2号废水中SO₄ ²⁻的最终去除率分别为91.28%、81.94%，对Fe²⁺、Mn²⁺的最终去除率分别为92.42%、79.39%。根据已有研究成果，褐煤对SO₄ ²⁻的去除率几乎为零^[18]。因此，L-P-SRB去除率SO₄ ²⁻主要依靠SRB的代谢作用。反应前期，SRB和球红假单胞菌适应新的废水环境后，球红假单胞菌活性增强、分解褐煤形成大量小分子的有机物，为SRB提供碳源，使SRB活性不断增强。1号废水中SO₄ ²⁻的去除率明显高于2号，因为高浓度的Mn²⁺对SRB和球红假单胞菌有抑制作用相反虽然中低浓度的Fe²⁺对细菌没有明显促进作用，但是直到80 mg/L的Fe²⁺对细菌也未见明显的抑制作用^[19]。反应后期，SO₄ ²⁻的去除速率变慢，这是因为体系中的碳源和电子减少，SRB的活性降低，SO₄ ²⁻的还原速率降低。

2.2   L-P-SRB对SO₄²的还原动力学和对Fe²⁺、Mn²⁺的吸附动力学分析

利用SO₄ ²⁻反应动力学方程式（1）和式（2），对L-P-SRB还原SO₄ ²⁻的过程进行零级与一级拟合，结果如图3、图4和表1所示。

表  1  SO₄ ²⁻反应动力学参数

Table  1.  Kinetic parameters of SO₄ ²⁻ reaction

项目	零级反应			一级反应
	k0/(mg·L−1·h−1)	R2		k1/h−1	R2
1号	5.610 6	0.896		0.019 65	0.955
2号	5.081 4	0.879		0.013 56	0.907

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图  3  SO₄ ²⁻的零级反应动力学拟合曲线

Figure  3.  Zero-order reaction kinetic fitting curve of SO₄ ²⁻

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图  4  SO₄ ²⁻的一级反应动力学拟合曲

Figure  4.  First-order reaction kinetic fitting curve of SO₄ ²⁻

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式中：C₀为初始SO₄ ²⁻质量浓度，mg/L；C_t为任意时刻 SO₄ ²⁻质量浓度，mg/L；k₀为零级反应速率常数，mg/(L·h)；k₁为一级反应速率常数，h⁻¹；t为反应时间。

由图3、图4和表1可知，1号和2号废水的一级反应动力学模型相关系数都要大于零级反应动力学模型相关系数。说明L-P-SRB对SO₄ ²⁻的还原动力学更加符合一级反应动力学模型。SO₄ ²⁻的还原主要受电子受体影响，废水中SO₄ ²⁻的主要去除过程是SRB异化还原作用^[20]。0~12 h，SO₄ ²⁻的去除速率较慢，主要体系中的SRB和球红假单胞菌适应废水环境，代谢较为缓慢。12~72 h，SO₄ ²⁻的还原速率达到最大值221.43 mg/(L·d)和209.98 mg/(L·d)，此阶段L-P-SRB中的球红假单胞菌比SRB生长周期更短，响应速度更快，在经过短暂适应后，球红假单胞菌率先对L-P-SRB中的褐煤进行分解，产生大量的碳源和电子，促进SRB对SO₄ ²⁻的还原。72 h后，球红假单胞菌和SRB的活性下降，导致SO₄ ²⁻的还原速率下降。120 h之后，微生物失活，SO₄ ²⁻的还原反应已基本停滞。

利用拟一级动力学反应模型式（3）和拟二级动力学反应模型式（4），对L-P-SRB吸附Fe²⁺、Mn²⁺的过程进行一级与二级拟合，结果如图5和表2所示。

图  5  Fe²⁺、Mn²⁺的吸附动力学拟合曲线

Figure  5.  Adsorption kinetics curve of Fe²⁺ and Mn²⁺

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表  2  Fe²⁺、Mn²⁺的吸附动力学参数

Table  2.  Adsorption kinetic parameters of Fe²⁺ and Mn²⁺

离子	拟一级动力学				拟二级动力学
	k1/h−1	qe/(mg·g−1)	R2		k2/(g·mg−1·h−1)	qe/(mg·g−1)	R2
Fe2+	0.030 1	0.515	0.976		0.389 0	0.666	0.971
Mn2+	0.032 4	0.316	0.996		0.089 6	0.385	0.994

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式中：q_e为吸附平衡时的吸附量，mg/g；q_t为吸附时间为t时刻的吸附量，mg/g；t为吸附时间，h；k₁为拟一级动力学反应速率常数，h^-1；k₂为拟二级动力学反应速率常数，g/(mg·h)。

由图5和表2可知，L-P-SRB吸附Fe²⁺、Mn²⁺的拟一级反应动力学模型相关系数都略大于拟二级反应动力学模型相关系数，说明L-P-SRB吸附Fe²⁺、Mn²⁺的过程更符合拟一级反应动力学，吸附以物理吸附为主。其中，L-P-SRB吸附Fe²⁺和Mn²⁺的拟一级反应动力学方程分别为：ln (0.515−q_t)= ln 0.515−0.030 1t, R²=0.976和ln (0.316−q_t)= ln 0.316−0.032 4t, R²=0.996。其中，拟合得L-P-SRB吸附Fe²⁺的q_e=0.515 mg/g与试验测得t =144 h时的平衡吸附量0.510 mg/g接近，拟合得L-P-SRB吸附Mn²⁺的q_e=0.316 mg/g与试验测得t =144 h时的平衡吸附量0.312 mg/g接近，说明拟合效果较好。

2.3   低温冷藏处理L-P-SRB对AMD中Fe²⁺、Mn²⁺的去除效果分析

低温冷藏处理L-P-SRB对AMD中Fe²⁺、Mn²⁺的去除效果如图6、图7所示。

图  6  L-P-SRB对Fe²⁺的去除效果

Figure  6.  Removal effect of L-P-SRB on Fe²⁺

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图  7  L-P-SRB对Mn²⁺的去除效果

Figure  7.  Removal effect of L-P-SRB on Mn²⁺

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由图6、图7可知，低温冷藏对L-P-SRB的活性影响较小，基本不会抑制L-P-SRB处理AMD中的Fe²⁺、Mn²⁺。低温冷藏对最终的去除率影响很小，主要是对前期处理速率有影响，对24~72 h的影响较为明显，原因是冷藏影响了SRB和球红假单胞菌的激活，延长了菌种的延滞期，但对细菌的活性没有影响。72 h之后达到了与没有冷藏的颗粒相同的效果。论证了L-P-SRB在低温条件下处理AMD的可行性，同时在实际生产过程中L-P-SRB可一次制备后经低温冷藏保存分多次使用，极大节约了生产成本，增加的水处理的灵活性。

0~72 h，Fe²⁺的去除速率较高，是因为球红假单胞菌代谢作用使L-P-SRB中的褐煤分解，使颗粒的孔隙率变大，有利于褐煤对Fe²⁺的吸附作用。同时，分解产生的小分子有利于SRB的生长繁殖，将SO₄ ²⁻还原为S²⁻，而S²⁻能和Fe²⁺进行反应生成硫化沉淀物，有利于Fe²⁺的去除。72~120 h，球红假单胞菌的活性下降，对颗粒褐煤的分解基本停止，导致吸附Fe²⁺达到饱和状态，SRB活性下降，Fe²⁺与S²⁻反应处于停滞状态，使Fe²⁺最终去除率基本稳定在91%左右。据报道，无载体的SRB菌液对低于10 mg/L的Mn²⁺无去除作用，高浓度的Mn²⁺对SRB和球红假单胞菌有明显的延滞和毒害作用^[8]。0~72 h，高浓度的Mn²⁺对红假单胞菌和SRB没有产生明显的抑制影响，说明在高浓度的重金属情况下，L-P-SRB可以对细菌产生隔离保护作用，有利于缩短菌种的延滞期，进而缩短水处理时间。MnS的溶度积常数较大（K_sp=2.5×10⁻¹⁵），因此这个阶段L-P-SRB去除Mn²⁺主要以是褐煤吸附Mn²⁺为主，仅有少量的Mn²⁺和S²⁻进行反应生成MnS沉淀。经冷藏处理的L-P-SRB对Mn²⁺的最终去除率为78%~79%。

2.4   L-P-SRB在处理Fe²⁺、Mn²⁺前后的SEM和FT-IR分析

将L-P-SRB和处理Fe²⁺、Mn²⁺后的L-P-SRB，置于电热鼓风干燥箱中105 ℃干燥24 h，使用JSM7200F扫描电镜进行SEM分析，对比L-P-SRB处理Fe²⁺、Mn²⁺前后的比表面和内部孔隙结构的变化规律。将上述干燥的样品进行研磨处理，使用赛默飞IS5型红外光谱仪进行红外吸收光谱分析，分析处理Fe²⁺、Mn²⁺前后L-P-SRB官能团的变化情况，揭示L-P-SRB处理Fe²⁺和Mn²⁺的机理。

由图8可知，L-P-SRB表面附着大量褐煤颗粒，这些褐煤可以作为吸附材料，率先发挥吸附作用。处理结束后，L-P-SRB表面的褐煤消失，可以证明球红假单胞菌适应水环境后会对褐煤进行分解，将褐煤分解为小分子物质。小分子会被SRB利用，促进SRB的生长，导致颗粒的表面出现大量的粗糙的沟壑，增大颗粒的比表面积，提供更多的附着点位，为重金属离子的吸附和SO₄ ²⁻的还原提供了足够的场所^[21]。对比图9、图10中L-P-SRB的结构可知，在处理废水时，L-P-SRB的褐煤被球红假单胞菌分解形成了蜂窝状结构，增加了颗粒的孔隙率，在这些空隙中SO₄ ²⁻可以被SRB还原为S²⁻，S²⁻与重金属离子反应生成了片状和零散无定形状的沉淀。

图  8  L-P-SRB反应前后的SEM图

Figure  8.  SEM diagram of before and after L-P-SRB reaction

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图  9  L-P-SRB处理1号含Fe²⁺废水后的SEM图

Figure  9.  SEM diagram of L-P-SRB after treatment of No.1 wastewater containing Fe²⁺

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图  10  L-P-SRB处理2号含Mn²⁺废水后的SEM图

Figure  10.  SEM diagram of L-P-SRB after treatment of No.2 wastewater containing Mn²⁺

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由图11可知，处理废水后，L-P-SRB在波数3 430 cm⁻¹处对应的—OH伸缩振动吸收峰增强。L-P-SRB颗粒中的褐煤被球红假单胞菌分解，颗粒表面的羧基和羟基官能团与水分子形成氢键，吸附在颗粒表面，导致L-P-SRB颗粒红外光谱中吸附游离水的—OH 伸缩振动吸收峰增强。处理废水后，颗粒在2 910 cm⁻¹附近的反对称—CH振动信号增强，此处对应的是甲基和亚甲基，表明球红假单胞菌够破坏褐煤结构中芳环与侧链之间的C—C，从而使褐煤中芳环结构与侧链断开。在1 600 cm⁻¹附近的—OH吸收峰减弱，说明L-P-SRB颗粒结构中有羟基水脱出，表明在水处理过程，球红假单胞菌使颗粒分子结构与羟基之间的化学键发生了断裂。这主要是L-P-SRB颗粒结构中的羟基与Fe²⁺和Mn²⁺发生配位作用，从而使羟基水脱出^[22-23]。1 400 cm⁻¹和1 100 cm⁻¹附近对应醚类、醇类、酚类的—OH和C—O伸缩振动峰增强，说明L-P-SRB颗粒结构中的C—O被破坏，生成了小分子的结构。600~850 cm⁻¹处复杂的C—H面外弯曲振动吸收峰发生了变化，说明L-P-SRB颗粒结构上发生了一定的崩塌变化，使结构更加的复杂。

图  11  L-P-SRB处理Fe²⁺、Mn²⁺废水前后的FT-IR谱图

Figure  11.  FT-IR Spectra of Fe²⁺ and Mn²⁺ wastewater before and after L-P-SRB treatment

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3.   结　　论

1）L-P-SRB对可以对SO₄ ²⁻起到很好的去除作用，对含Fe²⁺、Mn²⁺废水中SO₄ ²⁻的去除率分别91.28%、81.94%。说明球红假单胞菌可以分解褐煤形成小分子，为SRB提供碳源和电子，且为SRB提供载体和良好的生长代谢环境，促进SRB还原SO₄ ²⁻。L-P-SRB还原SO₄ ²⁻的过程为电化学还原过程，且一级反应动力学模型可以很好地描述该还原过程。

2）褐煤协同球红假单胞菌固定化SRB颗粒对Fe²⁺和Mn²⁺的去除率分别为91%和79%。L-P-SRB吸附Fe²⁺、Mn²⁺的过程以物理吸附为主，L-P-SRB吸附Fe²⁺和Mn²⁺的拟一级反应动力学方程分别为：ln(0.515−q_t)= ln0.515−0.030 1t，R²=0.976和ln(0.316−q_t)= ln0.316−0.032 4t，R²=0.996。L-P-SRB不但对金属离子有很好的的吸附作用，而且可以有效提升废水的pH。低温冷藏处理的L-P-SRB 对AMD中的Fe²⁺和Mn²⁺仍具有较好的效果，为低温条件下矿区处理AMD提供一定的依据。同时，L-P-SRB可一次制备后经低温冷藏保存分多次使用，节约了生产成本，增强了矿区处理AMD的灵活性。

3）通过SEM和FT-IR分析可知，球红假单胞菌对褐煤有一定的分解作用，破坏褐煤分子结构与羟基之间的化学键、使褐煤分子结构中的 C—C和 C=O断裂，增大颗粒的比表面积，使L-P-SRB的吸附能力增加。同时，为SRB提供载体，且能促进SRB的生长，对Fe²⁺、Mn²⁺和SO₄ ²⁻有很好的去除效果。