0 引 言
内蒙古地域辽阔，煤炭资源丰富，位居全国首位，分布着伊敏、霍林河、元宝山和准格尔等大型露天煤矿，是世界最大的“露天煤矿”之乡[1]；而东部集中分布的数个露天煤矿，东部区煤炭产能超过4亿t，电力装机约2 000 万kW。 使我国重要的畜牧业生产基地和北方天然生态屏障的内蒙古东部草原区成为重要的煤电基地[2]。 内蒙古东部草原区，气候干旱、寒冷，兼具放牧与农业生产方式，气候变化和过渡放牧导致草原退化严重[3]，而大规模露天采煤生产活动加剧了草原区的环境压力[2]。 煤炭的露天采煤过程，剥离表土破坏地表植被和景观，挖掘破坏地层结构、引起地下水流失和水位变化[4]、产生大量的废气废渣污染环境[5]，形成大面积的采挖坑及排土场损毁和压占土地(2017 年宝日希勒矿区及周边挖损土地面积5.088 km2，压占土地8.702 km2)[2]。 露天开采排土场土地复垦、地形地貌的重构以及人工植被建设工程，不仅改变了排土场土壤物理结构与化学性质[6-7]，也改变了植被类型、导致草原景观的破碎化[8]，影响生态系统的稳定性。 因此，露天煤矿复垦与环境治理的模式、修复技术与策略都有了极大的提高[9-11]。
土壤作为生物和非生物因子的复合体，维持着生态系统复杂的代谢循环过程。 其中土壤微生物不仅促进土壤有机质的分解和养分的转化，其数量和代谢活性的变化是受土壤环境因子、地上生物多样性以及其他干扰因素(生产方式)的影响[12]；源于土壤生物的细胞分泌物及残体分解物的土壤酶，可参与土壤中的各类物质代谢、循环和能量转化过程[13]；而土壤的物理结构和化学性质(含水量、pH、矿质元素)影响土壤养分运输、释放、形态转化和移动的组分，积极影响植物生长发育和系统代谢过程[14]。 研究显示，煤炭露天开采不仅影响矿区周边生物多样性，也影响矿区一定距离范围的土壤微生物且引起土壤理化性质的变化，从而影响土壤性状、代谢活性和土壤肥力[15-17]。 这些指标的变化在一定程度上反映对开采扰动的程度，具有重要的指示意义。 而目前对采矿矿坑干扰下(时空干扰)的周边自然区域中的土壤微生物活性及其变化机理研究较少。
大型露天煤矿的开采生产通常持续数十年，对生态环境的影响是一个持续扰动的过程。 随着开采的进程，采挖坑、排土场、采坑回填是不断移动和变化的，开采对生态环境的影响是一个复合与叠加的过程。 为了突出开采扰动影响的时空特点，笔者以地处寒温带草原区的宝日希勒露天煤矿北侧矿外草地为研究对象，依据试验设计，测定矿坑外围草地土壤微生物相关指标、酶活性和土壤理化的变化及其时空异质性，探索矿区周围土壤质量受露天采煤时间扰动和距离扰动的影响机制，以期为矿区生物修复提供一定的理论基础。
1 土壤生物活性的研究材料与方法
1.1 研究区概况
宝日希勒露天煤矿位于内蒙古自治区呼伦贝尔市陈巴尔虎旗宝日希勒镇境内，距呼伦贝尔市海拉尔区 20 km。 地 理 坐 标 为 东 经： 119° 23′56″—119°36′23″，北纬：49°19′24″—49°25′31″。 矿区煤炭资源储量为1 524.29 Mt，全区可采储量为1 264.08 Mt。 矿区地处亚寒带大陆性半干旱气候区，年均气温长期在-2.6 ℃左右，最低气温为-48 ℃，最高气温为37.7 ℃。 冬季严寒漫长，无霜期短，平均为110 d；夏季凉爽短促，雨期集中且降水少，春秋两季气温变化剧烈。 研究区为呼伦贝尔高平原典型草原区，以贝加尔针茅(Stipa baicalensis)和羊草(Leymus chinensis)建群，伴生有冰草(Agropyron cristatum)、糙隐子草(Cleistogenes squarrosa)、麻花头(Serratula centauroides)、冷蒿(Artemisia frigide)等植物，群落高度25～44 cm，植被盖度为50%～70%。 该区地带性土壤类型有淡黑钙土和暗栗钙土，且腐植层较薄，土壤养分较为贫瘠。
1.2 样地选择及样品采集
以宝日希勒露天煤矿北线外围草地为研究对象，依据采矿推进时间和方向，即矿区自西向东推进，在矿坑北线外的自然草地区，设置垂直矿坑北测线的试验样带A(矿坑采煤后回填区外围)、样带B(矿坑中央区外围)和样带C(矿坑东边缘正在采挖区外围)(图1)；再依据矿坑的干扰距离和影响强度在每条样带上设置距离矿坑300、600、900 m 处的样点 1、2、3，形成采样小区 A1、A2、A3，以此类推，其中C3 以距离最早开采区(矿坑采煤后回填区)干扰距离最远及受干扰时间最短作为对照。
采样于2017 年5 月进行。 在每个小样区设置1 m×1 m 的小样方3 个，去除表层浮土后分别取深度 0 ～ 10 cm、10 ～ 20 cm 和 20 ～ 30 cm 的土壤样品(分别记为L1、L2、L3)，每层多点采样充分混匀为一个样本，并收集于无菌塑封袋中。 采集的土壤低温贮藏，并迅速带回实验室：一部分土壤样品立即过2 mm 分样筛后于4 ℃保存，用于可培养微生物数量分析；一部分土壤样品自然风干后过0.5 mm 分样筛于4 ℃保存，用于蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶活性测定；另一部分土壤样品自然风干后过1 mm分样筛，用于土壤理化性质测定。
图1 宝日希勒露天煤矿矿区外样点示意
Fig.1 Schemetic diagram of outside sample sites of Baorixile open-pit coal mine
1.3 土壤微生物数量、酶活性及理化性质测定及分析
采用平板稀释涂布法进行可培养微生物计数，用牛肉膏蛋白胨培养基进行细菌数量测定，用高氏Ⅰ号培养基测定放线菌数量，用马丁-孟加拉红培养基进行真菌数量测定[18]。 采用赵兰坡等[19]改进的方法进行土壤磷酸酶活性测定。 土壤蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶活性的测定采用土壤酶试剂盒进行测定，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。 含水量测定采用烘干法，pH 值采用玻璃电极法进行测量(土水质量比＝1 ∶2.5)，铵态氮和速效磷有效钾用浙江托普云TPY-6PC 土壤养分速测仪测定，全氮用元素分析仪(elementar vario MACRO CUBE)进行测定(土壤过0.149 mm分样筛)，全磷采用氢氧化钠熔融——钼锑抗比色法进行测定[20]。
数据采用Excel 2013 统计，SPASS 20.0 差异显著性、Pearson 相关性及多因素交叉分析，以及GraphPad Prism 5.0 与 Omap 绘图。
2 露天采煤对土壤生物活性的影响结果分析
2.1 露天采煤对土壤微生物数量的影响
研究区内可培养土壤微生物数量由多到少依次为细菌、真菌、放线菌，其中细菌占比达90%以上(图2)，这与许多学者对北方土壤的研究结果一致[21-22]，其主要原因为中性及偏碱性环境有利于细菌及放线菌生长，而酸性环境有利于真菌的生长。不同土层土壤微生物数量多少顺序为L1＞L2＞L3，且L1 与L3 的差异显著(P＞0.05)。 可能是土壤表层中有机质和根系分泌物含量较为丰富，为微生物的生长和繁殖提供充足底物，其次是表层土壤通气性良好，有利于微生物完成其生活史[23]。
按露天煤矿开采推进时间梯度，即A1 向C1 方向，分别代表矿坑采煤后回填区A1、矿坑中央区B1及矿坑东边缘正在采挖区C1 和对照组C3。 比较A1 样地L1 ～L3 土层的细菌数量减少了 28.0%～0.6%，L1、L2 差异达到显著水平(P＜0.05)；真菌数量减少了40.5%～52.3%，各土层均达到差异显著(P＜0.05)；放线菌数量则减少了43.4%～19.0%，达到显著性差异水平(P＜0.05)；B1 样地土层 L1 ～L3的细菌数量减少了66.9%～45.2%，且差异达极显著水平(P＜0.01)；真菌数量减少了17.7%～66.2%，呈显著差异水平(P＜0.05)；放线菌数量减少了17.0%～6.7%，仅 L1 层达到显著性差异水平(P＜0.05)。 可见，靠近露天采煤矿坑区域土壤细菌、真菌和放线菌的数量显著降低，且不同微生物的响应变化不同。
图2 样地土壤微生物数量
Fig.2 Number of microbial colonies in soil of sample sites
随着采煤时间梯度增加，由C1 到A1 土壤细菌数量减幅呈现先升高后降低的趋势。 真菌数量的降低幅度变化没有明显的趋势。 而放线菌数量降低幅度的变化趋势为先降低后升高。 可见土壤微生物会对露天煤炭开采的干扰有一定的响应。 样带土壤细菌数量几乎在任何一层土壤中呈现C＞A＞B，而真菌数量呈现C＞B＞A，样带C 中每层土壤真菌数量显著大于样带B 和A，放线菌数量趋于呈现B＞C＞A，变化不显著(图3)。 可见开采时间越短对矿外土壤微生物数量的影响越小。
图3 不同样带间土壤微生物数量对比
Fig.3 Comparison of soil microbial quantity in different sample zones
随着垂直采坑边缘的距离梯度的增加，土壤细菌数量的降低幅度表现为：A 样带由A1 的28.0%～0.6%升高到A3 的59.5%～39.2%，B 样带中表现为降低的趋势，下降幅度范围土层 L1 为 66.9% ～20.0%、L2 为62.1%～17.4%，L3 为 45.2%～-1.2%，C 样带降低幅度变化趋势不明；真菌数量降低幅度表现出：样带A 中先降低后升高，L1 的降低幅度为31.5%～64.6%、L2 的降低幅度为30.2%～76.4%、L3的降低幅度为46.3%～72.8%，样带B 中降幅呈下降趋势，由B1 降幅 17.7%～66.2%至B3 的-34.5%～41.2%，样带C 的降低幅度没有明显的变化趋势；放线菌数量降低幅度变化表现为：A 样带由A1 降幅43.4%～19.0%升高至A3 的50.2%～33.3%，样带B中降低幅度变化趋势不明，样带C 中有降低趋势，由C1 到C2 降幅43.8%～14.3%至33.6%～14.3%。由上可见，研究区土壤微生物数量在采矿的时间梯度和强度梯度(距离矿坑近为高强度)呈不同变化趋势。 可见，微生物自恢复效应和露天采煤干扰效应表现出随着干扰强度梯度的降低而降低的趋势。在时间梯度上，B 样带土壤细菌数量呈现最低且降低幅度最大；在距离梯度上，B1 样点土壤细菌数量降幅在整个样带上最大，推测露天煤矿开采中央区对矿外土壤微生物数量的影响最大。 而样带A 开采时间早加之填埋完成，具有一定的自恢复效应。对于样带C，土壤微生物的数量几乎无变化，加之土壤微生物数量整体上大于其他2 条样带，可能是开采扰动时间短所致。
经过双因素综合分析可知(表1)，干扰时间对微生物数量影响极其显著(P＜0.01)，且通过多元线性回归得到细菌与真菌的干扰时间标准化回归系数分别是1.169 与0.646，较其他环境因子大，可见，干扰时间是影响矿外土壤微生物数量的主导因素。
表1 干扰时间和距离梯度对微生物数量的综合影响
Table 1 Effects of time and distance gradient on soil microorganism
P 值项目细菌 真菌 放线菌干扰时间 0.001 0 0.006干扰距离 0.444 0.074 0.283干扰时间×距离 0 0.061 0.100
随着土层深度的增加，细菌数量的降低幅度呈现降低趋势，A1 的降低幅度为28.0%～0.6%、B1 的降低幅度为 66.9% ～45.2%、C1 的降低幅度为38.7%～-31.3%，表土层降低幅度较大、深土层降低幅度较小。 相反，真菌数量的降低幅度，A1 为40.5%～52.3%、B1 为17.7%～66.2%，呈表土层变化幅度较小、深土层变化幅度较大，而C 中降幅变化趋势不明显；各样带放线菌数量变化幅度均是表层较大而深层较小。 土壤表层细菌、放线菌数量对煤炭开采的响应较大，而真菌的响应较低。
2.2 露天采煤对土壤酶活性的影响
土壤酶是土壤中重要的活性物质，参与了许多物质的循环，其中蔗糖酶催化糖类水解，用来表征碳元素的循环；脲酶能够催化含氮有机化合物水解，表征土壤氮素供应强度；磷酸酶用来表征有机磷的转化；过氧化氢酶可用于表征土壤腐植化强度和有机质积累情况[24]。 各样地的蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶的活性均随着土层深度的增加而降低(图4)，这与许多学者的研究结果一致[25-27]。
沿着采煤干扰时间梯度的增加，蔗糖酶活性降低幅度有升高趋势，从C1 各土层的-1.9%～30.4%和 B1 的 0.6% ～ -13.8%，升高至 A1 的 65.4% ～76.8%。 脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶也表现出相同趋势。 可见，随着干扰时间梯度的增加土壤酶活性降低程度有增加趋势。
随着采煤干扰强度梯度的降低，蔗糖酶活性降低幅度呈降低趋势(图 4)，样带 A 中，由 A1 的65.4%～76.8%降低为A3 的44.7%～65.9%；在样带B 中降低幅度略有升高的趋势；样带C 中降低幅度变化趋势不明。 脲酶降低幅度无明显变化趋势。 磷酸酶活性降低幅度呈现为下降趋势，A 样带中，L1 ～L3 各土层磷酸酶活性从 A1 至 A3 分别降低为15.1%～12.6%、27.6%～17.1%、24.1%～11.3%；样带B 中降低幅度无明显变化趋势；样带C 中磷酸酶活性均呈下降趋势。 过氧化氢酶的活性在样带A 中，由A1 的52.6%～47.4%降低为 A3 的 30.1%～26.5%，而样带B 中仅L2 和L3 土层表现出下降趋势，样带C 中变化趋势不明。 由此可见，蔗糖酶、磷酸酶和过氧化氢酶对煤炭露天开采的响应程度随着干扰强度梯度的降低呈现降低趋势。 相对于其他2 条样带，样带C 在时间梯度与距离梯度上变化小，土壤酶活性显著高于样带A，且样带A 的土壤酶活降低幅度最大，说明开采扰动时间是影响土壤酶活性的决定因素。
随着土层深度的增加，蔗糖酶活性各土层的降低幅度在A1 中表现为逐渐升高，样带B 和C 中降低幅度变化趋势不明。 脲酶活性变化幅度在A1 中由L1 土层的11.8%上升为L3 土层的52.9%，在B1中由L1 土层的-11.4%上升为L3 土层的4.7%，样带C 中降低幅度变化趋势不明。 磷酸酶活性变化幅度在样带A 中表现为升高趋势，在样带B 和C 中降低幅度变化趋势不明。 过氧化氢酶活性各土层的降低幅度在A1 中为52.6%～47.4%，表现出降低趋势；在 B1 中为 7.2% ～ 31.5%，C1 中为-8.5% ～19.1%，均表现出升高趋势。 可见，随着开采干扰时间的延长，土壤过氧化氢酶、脲酶活性随土层的变化趋势不同。
图4 研究区中土壤酶的活性
Fig.4 Several soil enzyme activity in the soil of sampling sites
对微生物数量与土壤酶活性进行相关性分析(表2)，结果表明细菌与酸性磷酸酶、中性磷酸酶、过氧化氢酶呈极显著正相关(P＜0.01)；真菌与脲酶和过氧化氢酶呈极显著正相关(P＜0.01)；放线菌与除蔗糖酶外的其他酶均呈极显著正相关(P＜0.01)。
表2 微生物数量与土壤酶活性的相关性分析
Table 2 Correlation analysis of the number of culturable microorganisms and soil enzyme activity
注：∗表示显著相关；∗∗表示极显著相关。
P 值土壤酶细菌 真菌 放线菌脲酶 0.108 0.328∗∗ 0.348∗∗酸性磷酸酶 0.378∗∗ 0.096 0.296∗∗中性磷酸酶 0.242∗∗ 0.090 0.390∗∗碱性磷酸酶 0.110 0.022 0.232∗∗蔗糖酶 0.107 0.085 0.078过氧化氢酶 0.245∗∗ 0.460∗∗ 0.460∗∗
2.3 露天采煤对土壤理化性质的影响
随着采煤干扰时间梯度的增加，含水量降低幅度均有升高趋势，C1 至A1 样带中，L3 升高幅度为1.1%～48.7%，B1 至 A1 样带中，L1 升高幅度为 36.8%～51.6%。 铵态氮升高幅度呈现升高的趋势，速效磷升高幅度有升高趋势，全氮降低幅度也有增大趋势，而全磷变化幅度趋势较为复杂。 由此可见，随着干扰时间的延长，含水量、铵态氮、速效磷和全氮对煤炭露天开采的响应有所提高，见表3。
随着采煤干扰强度梯度的降低，含水量降低幅度在样带A 中均呈现降低趋势，A1 至A3 样带中，L3 降低幅度最高为31.9%～48.7%；在样带B 中也有降低的趋势，B1 至 B3 样带中，L1 降低幅度为7.1%～36.8%；样带C 中降低幅度趋势不明。 铵态氮升高幅度在样带A 中L1、L2 土层表现出降低的趋势，在样带 B 中 L1、L2、L3 土层和样带 C 的 L1、L2 土层也表现出降低趋势。 速效磷升高幅度无明显趋势。 全氮降低幅度在样带 A 的 L1、L2 土层表现出降低趋势，而样带B 和C 变化趋势复杂。 全磷降低幅度在样带A 中的L1、L2 土层表现为降低趋势，而样带B 和C 变化趋势不明。 由此可见，含水量和铵态氮的变化随着距离梯度的增加呈现降低趋势，而全氮仅在干扰时间长的样带表现出此趋势。
表3 露天煤炭开采对土壤理化性质的影响
Table 3 Influence of open-pit coal mining on soil physicochemical properties
注：±前后的数据分别为平均值和标准差； 同一指标同列数据后不同字母 a、b、c、d、e、f、g、h 表示在 0.05 的水平上差异显著。
土层深度/cm 样地 含水量/% 铵态氮含量/(mg·kg-1) 速效磷含量/(mg·kg-1) 全氮含量/(g·kg-1) 全磷含量/(g·kg-1)
随着土层深度的增加(表3)，铵态氮各土层的升高幅度在A1 中呈逐渐降低趋势，样带B 和C 中升高幅度变化复杂无明显趋势。 速效磷化幅度在A1 中由L1 土层的33.9%上升为L3 土层的145.5%，在B1 中由 L1 土层的-8.3%上升为 L3 土层的68.2%，样带C 中变化幅度的趋势不明。 含水量、全氮和全磷土层间变化较为复杂，无明显趋势。 由此可见，土壤理化的垂直梯度变化较为复杂，无明显变化趋势。
通过对微生物数量与土壤理化性质进行相关性分析(表4)，结果表明细菌、真菌及放线菌均与全氮呈极显著正相关(P＜0.01)；真菌还与含水量呈显著相关(P＜0.05)；放线菌与含水量呈极显著正相关(P＜0.01)。
表4 微生物数量与土壤理化的相关性分析
Table 4 Correlation analysis of the number of culturable microorganisms and soil physicochemical properties
注：∗表示显著相关；∗∗表示极显著相关。
土壤理化 P 值细菌 真菌 放线菌含水量 0.069 0.170 0.170∗铵态氮 0.124 0.109 0.109速效磷 0.102 -0.049 -0.049全磷 -0.104 0.003 0.003全氮 0.232∗∗ 0.582∗∗ 0.582∗∗
3 结 论
1)随着露天开采扰动强度增加(离矿坑距离越近)，宝日希勒煤矿矿坑周边土壤中细菌、真菌和放线菌的数量，蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶的活性，以及土壤含水量、全氮含量呈降低趋势，而土壤铵态氮和速效磷含量有升高趋势。
2)开采扰动时间的延长，对土壤放线菌，蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶，土壤含水量、铵态氮、速效磷和全氮的影响加强；而对细菌和真菌的影响减弱。 由研究结果可见，中央采矿区对土壤生物活性的影响较大，开采时间越短对矿外土壤微生物数量的影响越小，随着开采扰动时间序列的增加，露天矿周边环境土壤中生物活性成分对露天采煤干扰具有一定的自我修复能力，但土壤理化性质的恢复需要较长时间。 初步判断采矿扰动时间是影响矿坑周围土壤生物活性的显著因素。
3)扰动效应和土壤生物活性物质的修复效应均随干扰强度梯度的降低而减弱。
4)随着干扰时间的延长，不同土层过氧化氢酶所受到的影响强度是有变化的，而土壤理化无明显变化趋势。 可见土壤中的生物活性物质垂直恢复效应会随着时间而变化，且不同生物活性物质的恢复进程不尽相同。
5)土壤生物活性与土壤酶活性的相关性联系较大，与土壤理化性质相关性有限。 其中细菌数量与酸性磷酸酶、中性磷酸酶、过氧化氢酶活性呈极显著正相关(P＜0.01)；真菌数量与脲酶和过氧化氢酶活性呈极显著正相关(P＜0.01)；放线菌数量与脲酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、中性磷酸酶、过氧化氢酶均显著正相关(P＜0.01)。 细菌、真菌及放线菌的数量均与全氮含量呈极显著正相关(P＜0.01)；真菌和放线菌还别与土壤含水量呈显著(P＜0.05)和极显著正相关(P＜0.01)。
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