0 引 言
煤炭是我国最主要的能源产品，近5 年每年煤炭产量均维持在34 亿t 以上。 我国95%左右的煤炭为井工矿开采，大规模的煤炭开采导致出现大面积地表沉陷，目前沉陷区面积约20 000 km2，且每年仍以约700 km2的速度递增[1-2]。 采煤沉陷会产生大量的地表裂缝，破坏原有土体结构，导致土壤保水保肥能力下降[3]。 煤炭开采后地表不均匀沉降会造成植物根系损伤，影响植物生长甚至造成植物死亡，加剧了西部矿区水土流失和荒漠化程度[4]。 同时地表沉陷改变了植物根际微环境，根际微生物和酶活性下降，矿区环境生态受到严重威胁[5]，因此采取有效措施进行植被恢复、保护和改良矿区土壤具有重要意义。 丛枝菌根真菌( Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF)是土壤中重要的微生物，可以与超过80%的陆生植物形成共生关系[6]。 菌根可以通过形成根外菌丝增加植物根系吸收面积，改善植物养分和水分状况，提高植物对外界生物和非生物胁迫的耐受性[7]，促进植物生长和产量提高[8]。 菌根通过分泌球囊霉素，显著改善土壤质量[9]。 同时有研究表明菌根可能影响植物群落结构，且在植物群落演替中起着关键作用，对维持植物群落结构和功能稳定性起着重要作用[10-11]。 近年来，菌根微生物在矿区生态修复中的潜在作用已经被逐渐认识，并成为矿区复垦研究的热点[12-13]。 但是目前大多数研究集中于实验室研究或野外较短时间内应用效果，而对野外沉陷矿区内接菌后较长时间生态效应报道较少。 基于此，笔者以采煤沉陷地紫花苜蓿为研究对象，研究了采煤沉陷地内接种菌根真菌4 年后对紫花苜蓿生长及土壤改良效果的影响，研究可为菌根修复技术在矿区生态修复治理应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 研究区概况
研究区位于陕西省神木县中鸡镇活鸡兔矿井采煤沉陷区内。 该区位于陕北黄土高原沟壑区与毛乌素沙地的过渡地带。 研究区属于中温带半干旱大陆性季风气候，冬冷夏热，年平均气温7.3 ℃，年均降雨量约350 mm，年均蒸发量为1 500 mm，降雨主要集中在6～9 月。 2009 年对活鸡兔采煤沉陷区进行复垦。 复垦区土壤质地为粗砂土，土壤基础指标为：土壤pH 值7.48，碱解氮含量11.75 mg/kg，速效磷含量1.0 mg/kg，有机质含量6.07 g/kg。 复垦样地分别设置了接菌处理(+M)和非接菌对照(CK)处理，2 个小区的面积均为600 m2，种植植物为紫花苜蓿(Medicago sativa L.)，播种量为 15 kg/hm。 接菌处理供试菌种为摩西管柄囊霉( Funneliformis mosseae)，为当地适生优势菌种。 菌剂为中国矿业大学(北京)微生物复垦实验室增殖扩繁，接种菌剂为含有菌根真菌孢子、根外菌丝及侵染根段的根土混合物，菌丝密度为4.6 m/g，孢子密度为65 个/g。菌剂使用量为50 kg/hm2。 将种子和菌剂按比例混合均匀后撒播。 开始每7 d 浇水1 次，1 个月后每14 d 浇水，3 个月以后自然生长。
1.2 样品采集
复垦4 年后，于2013 年7 月进行样地调查及样品采集。 分别在接菌区和对照区小区内以“S”形取样法随机设置5 个1 m×1 m 的样方。 调查样方内植物株高、盖度，同时收割样方内植物地上生物量。采集地下根系和新鲜根际土样，装入无菌塑封袋内，低温条件下尽快带回实验室。 采集的根系用于测定菌根侵染率。 采集土样过2 mm 土壤筛，一部分土样保存于4 ℃冰箱，用于测定土壤酶活性；另一部分自然风干，用于测定土壤理化性质和菌丝密度。
1.3 指标测定与分析方法
植物指标：株高用钢尺测定，SPAD 值采用SPAD 仪测定，植物生物量采用称重法测定。
土壤理化指标：土壤含水量采用烘干法测定，pH 值采用 pH 计测定(水土质量比为 2.5 ∶1.0)，土壤碱解氮采用碱解扩散法测定，土壤有机质采用外加热法测定，有效磷采用钼锑抗比色法[14]。 磷酸酶活性采用改进的Tabatabai 和Brimner 方法。
菌根侵染率和菌丝密度的测定：菌根侵染率采用染色法[15]，菌根侵染率＝菌根段数/观察根段数；菌丝密度采用真空泵微孔滤膜抽滤-网格交叉法测定[16]。
所有数据采用 Excel 2013 软件处理，使用Origin 2017 进行绘图。 采用SAS 8.0 对试验数据进行统计分析，使用单因素方差分析法进行方差分析，显著性水平选择α ＝0.05。 用Pearson 法对植物生长、菌根侵染、土壤参数进行相关分析。
2 结果与分析
2.1 接种菌根对苜蓿生长的影响
复垦4 年后，接种菌根对苜蓿的生长具有显著促进作用(表1)。 接种菌根处理植物株高、SPAD值、生物量分别为 37.6 cm、44.2、1 525.3 g/m2，较对照分别提高 18.2%、8.3%、10.4%，差异显著(P ＜0.05)。
表1 接种菌根对苜蓿生长的影响
Table 1 Effects of mycorrhizal inoculation on alfalfa growth
注：数值为均值±标准误差；同列a、b 表示不同处理在α ＝0.05水平上有显著差异(LSD 法)，下同。
处理方法 株高/cm SPAD 值 地上生物量/(g·m-2)CK 31.8±1.7b 40.8±1.3b 1381.8±68.0b+M 37.6±1.8a 44.2±1.4a 1525.3±37.1a
2.2 接种菌根对侵染率和菌丝密度的影响
菌根侵染率可反映植株根系与菌根的共生关系。 如图1 所示，未接菌处理植物根系侵染率为34.7%，而接种菌根处理菌根侵染率达到46.7%，较对照处理提高35%，且差异显著(P＜0.05)，表明强化接菌4 年后菌根仍可与苜蓿根系形成良好的共生关系，并保持菌根优势。 同时，接种菌根处理菌丝密度增加，达到4.96 m/g，较对照提高34.1%，土壤中菌丝密度的增加可大幅增加植株根系的吸收面积，促进植株对土壤养分和水分的吸收，有利于植物生长。
2.3 接种菌根对土壤性状的影响
接种菌根4 年后，根际土壤质量得到改善(表2)。 与对照相比，接菌处理土壤pH 值有下降趋势，差异不显著(P＞0.05)。 接菌处理有效提高了土壤含水量，较对照提高了7.5%，但差异不显著(P ＞0.05)。 接菌后，土壤碱解氮、速效磷、有机质、磷酸酶活性显著提高，较对照分别提高21.4%、20.7%、22.5%、36.9%(P＜0.05)。 同时与复垦前土壤参数相比，复垦4 后土壤pH 值有所增加，种植苜蓿及接种菌根处理均有效提高了土壤速效磷、碱解氮、有机质含量，而接种菌根对土壤改良有显著的加速作用，有利于更快速恢复受损矿区生态。
图1 不同处理方法苜蓿菌根侵染率和菌丝密度
Fig.1 Mycorrhizal infection rate and mycelium density of different treatments
表2 接种菌根对苜蓿根际土壤性状影响
Table 2 Effects of mycorrhizal inoculation on rhizosphere soil characteristics
方法 含水量/% pH 值 碱解氮含量/(mg·kg-1)处理速效磷含量/(mg·kg-1)有机质含量/(g·kg-1)磷酸酶活性/(μmol·g-1·h-1)CK 5.67±1.04a 7.70±0.05a 21.28±2.02b 2.42±0.19b 11.04±0.98b 2.25±0.24b+M 6.10±0.73a 7.63±0.07a 25.83±1.09a 2.92±0.43a 13.52±1.12a 3.08±0.21a
2.4 相关性分析
相关性分析表明(表3)，菌根侵染率与株高、生物量、磷酸酶、速效磷呈显著正相关(P ＜0.05)，与pH 呈显著负相关(P＜0.05)，与菌丝密度、SPAD、碱解氮呈极显著相关(P＜0.01)。 菌丝密度与SPAD、有机质呈显著正相关(P＜0.05)，与株高、生物量呈极显著正相关(P＜0.01)。 表明菌根在植物生长和土壤养分转化过程中起着重要作用。 同时分析可知，土壤速效磷与土壤磷酸酶极显著正相关(P ＜0.01)，而与碱解氮呈显著正相关(P＜0.05)。 土壤有机质与磷酸酶活性、碱解氮、速效磷呈显著正相关(P＜0.05)。
表3 菌根侵染、植物生长、土壤参数相关性分析
Table 3 Correlations between infection rate， external hyphal density， plant growth and soil characteristics
注：∗∗表示在0.01 水平上相关性显著；∗表示在0.05 水平上相关性显著。
项目 侵染率 菌丝密度 株高 SPAD 生物量 pH 值 磷酸酶 碱解氮 速效磷 有机质菌丝密度 0.79∗∗株高 0.68∗ 0.88∗∗SPAD 0.80∗∗ 0.64∗ 0.59生物量 0.74∗ 0.84∗∗ 0.77∗∗ 0.62 pH 值 -0.66∗ -0.34 -0.29 -0.56 -0.23磷酸酶 0.74∗ 0.55 0.48 0.62 0.63 -0.49碱解氮 0.77∗∗ 0.62 0.62 0.50 0.54 -0.32 0.75∗速效磷 0.66∗ 0.43 0.34 0.41 0.61 -0.20 0.80∗∗ 0.64∗有机质 0.62 0.76∗ 0.69∗ 0.32 0.58 -0.17 0.66∗ 0.71∗ 0.66∗土壤含水量 0.38 -0.14 -0.22 0.44 -0.02 -0.63 0.46 0.28 0.21 -0.25
3 讨 论
3.1 丛枝菌根真菌与植物生长发育的关系
我国西部矿区煤炭井工开采后地表大面积塌陷，导致土壤结构的破坏和和植被损毁，对脆弱的西部矿区生态环境造成严重威胁。 通过菌根微生物技术提高植被覆盖、改善土壤环境是改善矿区环境的重要途径之一。 大量研究表明，菌根与植物形成共生关系后可在宿主植物根围形成大量菌丝，大幅增加了根系的吸收面积，从而改善了植物营养状况和水分条件[17]。 本研究中，接菌4 年后接菌处理株高、SPAD、生物量均显著高于对照处理，表明接种菌根可显著促进植物的生长和干物质积累，研究结论与文献[18-19]的研究结果一致。 煤炭开采后植被生长受到采煤沉陷的消极影响，植被盖度下降，加之地表产生大量采煤地表裂缝，沉陷区水土流失严重，而植被的快速生长、地上生物量增加可以快速提高采煤沉陷区植被盖度，从而有效减缓矿区水土流失和土壤风蚀，这对于西部干旱半干旱受损矿区恢复具有重要意义[20]。 同时苜蓿作为一种很好的饲料，接种菌根提高了苜蓿产量，可以为当地畜牧业的发展提供饲料来源。
自然土壤中含有大量的菌根资源，并可与植物形成共生关系[21]。 本研究中，未接菌处理苜蓿根系有侵染，而复垦4 年后接菌处理菌根侵染率和菌丝密度显著高于对照处理，保持菌根优势，表明菌根接菌处理可以在较长时间段内发挥作用，这对于西部脆弱矿区的修复具有重要意义。 表明在采煤沉陷地进行菌根微生物修复是一种经济、可持续的修复手段。
3.2 丛枝菌根真菌对植物根际土壤因子的影响
水分是维持西部矿区生态环境稳定的关键性因子。 接种菌根后提高了植物根际土壤含水量，与文献[22]的研究结果相一致。 这可能是由于菌根可以通过分泌球囊霉素等促进土壤团聚体形成，从而提高土壤的保水能力，进而缓解矿区水分胁迫对植被生长的影响[23]。
矿区土壤养分贫瘠，苜蓿作为一种豆科植物，可以通过根际固氮菌固定氮素。 本研究中，接种菌根后土壤中碱解氮含量较对照有显著提高，表明菌根在一定程度上可以促进土壤中微生物循环，与土壤中固氮菌协同作用促进土壤中氮素的固定和增加，研究结果与IBIJBIJEN 等的研究一致[24]。 磷是土壤中的重要元素，也是限制西部干旱矿区植被生长发育的重要因素。 研究表明，菌根可以通过分泌有机酸及酶等促进土壤中磷的释放。 本研究中，接种菌根处理土壤磷酸酶活性和土壤速效磷含量均显著高于对照且显著相关，表明接菌促进了苜蓿根际土壤磷转化，研究与王瑾等[25]研究结果相一致。 同时，接种菌根还显著提高了土壤有机质含量，这可能是因为接种菌根促进了苜蓿生长，更多的枯落物进入土壤，促进了土壤碳循环[26]。 本研究仅对接种菌根4 年后复垦效果进行了调查分析，对于更长时间的生态效应及其对根际微生物群落影响等有待于进一步研究。
4 结 论
1)采煤沉陷地内人工接种丛枝菌根可与紫花苜蓿形成良好互利共生关系，与未接菌处理相比，接种菌根处理菌根侵染率和菌丝密度显著增加，菌根优势明显。
2)接菌4 年后，接种菌根显著促进植物株高、SPAD、地上生物量增加，有利于植物快速生长和干物质积累。 同时土壤中有机质、碱解氮、速效磷和磷酸酶活性显著提高，土壤质量显著提高。
3)与复垦前的土壤指标相比，复垦4 年后土壤质量得到了较为显著改善，接种菌根加速了土壤的改良速度。 野外接种丛枝菌根可以在较长时间内有效促进植株生长、改善土壤质量，生态效应显著，对矿区长效生态修复和土壤环境改善具有重要意义。
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