0.   引　　言

煤炭开采过程造成表土的剥离与挖掘、煤炭资源的运输和倾倒会破坏原有土层结构^[1]，致使土壤养分损失，酶活性降低，土壤微生物多样性锐减，土壤功能稳定性减弱^[2]，土地生产力和地表植被受损^[3-4]。在绿色开采煤矿的同时，采取灵活有效的途径增加土壤养分，实现快速高效的植被恢复，是保障采矿区生态环境高质量发展的首要任务^[5]。

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为多年生豆科草本植物，具有耐寒、抗旱、较强的再生能力和广适性，其根系发达，可改善土壤养分，优化土壤结构^[6]，是矿区生态修复的首选植物。此外，紫花苜蓿还具有良好的培肥作用，其根系分泌物释放增加土壤有机质^[7]，其根、茎、叶翻压、腐解可作为绿肥^[8]。秦嘉海等^[9]发现在黑河流域的草甸盐土种植紫花苜蓿3年后地表覆盖度达95%～98%，土壤速效氮、磷、钾含量增加。

为提高矿区植被的抗逆性能，利用具有促生作用的微生物进行联合修复，是目前矿区生态修复常用的技术手段。深色有隔内生真菌(Dark Septate Endophytes，DSE)是一类以深色菌丝和微菌核结构定殖于植物根系组织细胞内和细胞间隙的内生真菌^[10]。DSE在多种植被中广泛存在，无宿主特异性，且不会对宿主植物产生病害作用，同时具有促进植物生长、提高宿主抗逆性的特性^[11]。DSE还能增强植物应对干旱^[12]、盐胁迫^[13]以及抵御病虫害的能力^[14]。微生物会分泌具有活性的生长刺激素，可以增加植物养分含量、提高植物非生物胁迫耐受性和改善植物品质性状^[15]。徐润冰^[16]发现DSE分泌的酸性磷酸酶，能将难溶态磷转化为容易被植物吸收的可溶态磷，进而促进植物生长^[17]。DSE也可以分泌蛋白水解酶，矿化土壤中的蛋白质和肽，使氮以无机形式供植物吸收利用^[18]。此外，DSE分泌的生长素、氨基酸、糖类等代谢物^[19]具有促进植物获取养分、增强植物抗性^[20]的功能。DSE代谢物具有作为植物生物刺激素的潜在用途^[21]，代谢物中的化合物会影响植物在分子水平上的反应，促进色素、激素、抗氧化剂和生物碱的生物合成^[22]。

菌剂的接种方式会影响其对植物的促生效果。黄望启等^[23]用农杆菌在植物移栽时对植物幼根进行浸泡，TINNA等^[24]将洋葱幼苗移栽前用微生物菌剂浸根可以提高洋葱对营养物质的吸收，进而提高洋葱产量,大面积农田作物的接种也可将一定浓度的液体菌剂溶于灌溉水中对根系进行接种^[25]。此外，笔者等^[26]通过叶面涂抹施加DSE提高了蛋白桑生长速率及品质。

目前，DSE的研究主要集中在其与植物的互作机理以及DSE多样性上，不同接种方式下DSE及其代谢物对植物的促生效果研究较少。以紫花苜蓿为研究对象，探究浸根和模拟土培2种接种方式下DSE及其代谢物对紫花苜蓿生长特性的影响，筛选促进植物生长的最适接种方式，是植被恢复前期帮助幼苗在矿区恶劣条件下快速生长的有效方式。

1.   材料与方法

1.1   供试材料

供试植物紫花苜蓿为矿区生态修复常用物种。水培溶液为1/2 霍格兰营养液(各物质质量浓度分别为：硫酸钾 303.5 mg/L，磷酸铵 57.5 mg/L，硫酸镁 246.5 mg/L，EDTA铁钠盐 10 mg/L，硫酸亚铁 1.43 mg/L，硼砂 2.25 mg/L，硫酸锰 1.065 mg/L，硫酸铜 0.025 mg/L，硫酸锌 0.11 mg/L，硫酸铵 0.01 mg/L，钙盐 472.5 mg/L)。

供试菌种从内蒙古自治区锡林浩特市胜利露天矿外围草原区克氏针茅(Stipa krylovii)根部分离纯化获得，测序鉴定为链格孢属(Alternaria sp.)，是植物根内DSE常见的种属之一^[27]，保存于中国矿业大学(北京)微生物复垦实验室。

将Alternaria sp.接种至PDA固体培养基(各物质质量浓度分别为：马铃薯淀粉 6.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，琼脂 20.0 g/L，购自北京酷来搏科技有限公司)，28 ℃黑暗倒置培养14 d，得到Alternaria sp.菌落。在无菌条件下取直径7 mm 的菌饼，然后置于MMN液体培养基(氯化钙 0.05 g/L，氯化钠 0.025 g/L，氯化铁 0.01 g/L，硫酸镁 0.15 g/L，磷 0.0001 g/L，葡萄糖 10.0 g/L，柠檬酸 0.2 g/L，麦芽提取物 10.0 g/L，购自北京酷来搏科技有限公司)，28℃、180 r/m振荡培养8 d得到DSE菌液。将DSE菌液分装于10 m/L离心管，于4 ℃、10000 r/m离心15 min，取离心管内上清液过0.22 µm的滤膜，滤液即为DSE代谢物，离心管内固体物质即为DSE，将DSE与DSE代谢物保存备用。

供试基质为玻璃珠和无菌水，玻璃珠直径为1 mm，用高温灭菌锅将去离子水灭菌30 min后得到无菌水。

1.2   试验设计

试验在西安科技大学西部矿山生态环境修复研究院水培室进行。选取颗粒饱满、大小一致的紫花苜蓿种子，用体积分数为75%的乙醇处理种子3 min，再用体积分数为10%的H₂O₂溶液浸泡15 min后用无菌水冲洗干净，备用。

将250 g高温灭菌的玻璃珠放入直径7.9 cm，高7.5 cm的花盆中，每盆播种25粒上述紫花苜蓿种子，并浇1/2霍格兰营养液50 mL，共种植24盆。植物出芽后生长在自然光14 h（（25±3） ℃）和黑暗10 h（（20±3） ℃）的环境中。生长10 d后进行间苗，每盆保留长势一致的幼苗10株。12盆用于模拟土培方式接种试验，12盆用于浸根方式接种试验。

模拟土培接种试验植物生长基质为玻璃珠，设置接种DSE(DH)、DSE代谢物(DM)、DSE +DSE代谢物(DH+DM)及空白对照(CK)四个处理，用镊子在盆中扎小孔，将DSE及其代谢物倒入小孔并拨动玻璃珠覆盖。按照质量比1∶100添加DSE和DSE代谢物，分别接种2.5 g DH，2.5 mL DM，2.5 gDH+2.5 mL DM，CK添加2.5 mL无菌水，每个处理3个重复。生长期间称重浇灌营养液，保持含水率为50%~60%。一周后移入水培盒（12.7 cm×8.7 cm×11.4 cm）中进行培养试验。

水培盒中加入1/2霍格兰营养液800 mL，将10株紫花苜蓿幼苗移入水培盒并进行固定，在试验期间，在水培盒中连续充气。每天添加营养液以保持液体体积。

浸根方式接种试验先将植物移入水培盒，水培试验设计同上。试验处理同模拟土培试验。按照质量比1∶100接种DSE和DSE代谢物，分别在水培盒中接种8 g DH，8 mL DM，8 g DH+8 mL DM，CK添加8 mL无菌水，直接将DSE及其代谢物倒入水培盒内，每个处理3个重复。一周后水培盒更换1/2霍格兰营养液。植物生长47 d后收获，进行各项指标的测定。

1.3   测定指标与方法

1.3.1   紫花苜蓿根系DSE的定殖

随机取少量细根样冲洗干净，放在适宜大小的试管中。加入10%KOH溶液(10 g KOH溶于100 mL蒸馏水)放于恒温水浴锅(90 ℃)加热至透明为止。加热后将试管取出倒出KOH，用清水漂洗干净后加入染色液(酸性品红)浸泡，于90 ℃恒温水浴锅加热30 min进行染色。将上述已染色的根段用清水漂洗加入脱色液(乳酸与甘油与水质量比为1∶1∶1)静置过夜脱色，脱色后将根系切成长1.0～1.5 cm根段，随机选取30根制片，放于显微镜下观察，分别记录总定殖率、菌丝定殖率和微菌核定殖率^[28]。计算公式如下：

式中：C_x为定殖率；A为定殖根段数；B为总根段数。

1.3.2   紫花苜蓿生长状况

每个处理10株紫花苜蓿，收获后用无菌水冲洗根部粘连菌丝后，用分析天平称重测定植株地上部鲜重和根鲜重，根冠比计算式为

式中：R_sr为根冠比；R_b为根鲜重；S_b为地上部鲜重。

1.3.3   紫花苜蓿叶绿素含量的测定

采用乙醇法^[29]测定叶绿素含量：取新鲜植物叶片于研钵中，加入碳酸钙和石英砂与95%乙醇进行破碎浸提，研磨成浆后静置3～5 min。静置后过滤至25 mL容量瓶定容。后用分光光度计分别在波长665、649、470 nm处测定滤液的吸光度，计算叶绿素a(C_a)、叶绿素b(C_b)、类胡萝卜素(C_xc)含量及总叶绿素含量(C_T)，mg/L。

式中：A₆₆₅、A₆₄₉、A₄₇₀分别表示波长在665、649、470 nm的吸光度。

1.3.4   紫花苜蓿根系构型的测定

植物根部黏连菌丝用清水漂洗干净后用Microtek ScanMaker i800 plus进行根系扫描，并用根系表型分析系统V2.3.2软件分析根系表型结构，获得植物根长、根表面积、根体积、平均直径、根尖数。

1.3.5   紫花苜蓿营养元素的测定

植物样品烘干磨碎后用H₂SO₄−H₂O₂消煮，消煮至溶液澄清透明后静置冷却，用凯氏定氮仪测定植株全氮含量^[30]，用电感耦合等离子发射光谱仪(ICP-OES)测定植株全磷和全钾含量^[31]。

1.4   数据处理

采用Excel 2013软件处理数据，使用Origin2019进行绘图。试验数据通过spss20.0进行单因素方差分析(ANOVA)，显著性水平选择α=0.05。采用R语言corrplot包进行相关性分析。使用R语言Vegan包进行分解分析。

2.   结果与分析

2.1   DSE及其代谢物对紫花苜蓿根系DSE定殖率的影响

DSE及其代谢物在紫花苜蓿根系定殖效果如图1所示。在显微镜下观察，CK和DM处理的紫花苜蓿根系均没有发现DSE定殖。由图1a和1c可知，与模拟土培相比，浸根方式紫花苜蓿根系DSE以菌丝方式为主要定殖方式，DH、DH+DM处理菌丝侵染率与模拟土培相比分别提高了7.67、9.33倍，DH、DH+DM处理总定殖率与模拟土培相比分别提高了2.71、5.2倍。由图1b可知，DH处理有助于微菌核定殖于紫花苜蓿根系。定殖率最高可达15.56%。

图  1  DSE及其代谢物对紫花苜蓿根系定殖率的影响

注：相同字母表示采用“Duncan test”检验，组间没有显著差异（P>0.05），不同字母表示有显著差异（P<0.05）。

Figure  1.  Effect of DSE and metabolites on root colozination rate in Medicago sativa L.

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2.2   DSE及其代谢物对紫花苜蓿生长特性的影响

DSE及其代谢物对紫花苜蓿鲜重的影响如图2所示。浸根方式和模拟土培方式接种DSE及其代谢物均能增加紫花苜蓿地上部鲜重、根鲜重、总鲜重，浸根方式作用效果表现为DH+DM>DH>DM>CK，模拟土培作用效果表现为DM>DH+DM>DH>CK。浸根方式DM、DH+DM处理较CK相比根冠比增加。模拟土培较CK相比，DH+DM处理根冠比增加。整体来看，浸根方式DH+DM对紫花苜蓿的促生效果最好(P<0.05)，地上部鲜重、根鲜重、总鲜重较CK分别增加了83.54%、84.15%、83.78%。模拟土培DM对紫花苜蓿的促进作用最明显(P<0.05)，地上部鲜重、根鲜重、总鲜重较CK分别增加了97.37%、88.77%、94.25%。

图  2  DSE及其代谢物对紫花苜蓿生长特性的影响

Figure  2.  Effect of DSE and metabolites on the growth characteristics of Medicago sativa L.

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2.3   DSE及其代谢物对紫花苜蓿光合作用的影响

DSE及其代谢物对紫花苜蓿叶绿素含量的影响如图3所示。浸根方式接种DSE及其代谢物叶片叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量高于CK，DH、DM、DH+DM处理叶绿素a较CK分别增加7.58%、21.91%、32.14%，叶绿素b含量较CK分别增加1.02%、43.65%、43.19%，总叶绿素含量较CK分别增加5.57%、28.59%、35.54%。DH、DH+DM处理可增加类胡萝卜素含量(图3b)，较CK相比分别增加2.54%、12.77%。模拟土培叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量表现为DM>DH>CK>DH+DM。类胡萝卜素含量表现为CK>DH>DM>DH+DM。

图  3  DSE及其代谢物对紫花苜蓿的叶绿素含量的影响

Figure  3.  Effect of DSE and metabolites on chlorophyll content in Medicago sativa L.

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2.4   DSE及其代谢物对紫花苜蓿根系构型的影响

DSE及其代谢物对紫花苜蓿根系结构的影响如图4所示，对植物根系扫描和数据化处理获得根系表型结构(根系长度、平均直径、根体积、表面积、投影面积、根尖数)见表1。由表1可知，浸根方式各处理根系长度增加，DH、DM、DH+DM较CK分别提高59.31%、16.42%、38.13%。根体积表现为DH+DM>DM>DH>CK，其中，DH+DM较对照显著(P<0.05)增加132.12%。根尖数增加，表现为DH+DM>DH>DM>CK。模拟土培DH、DM、DH+DM处理较CK根系长度分别增加23.30%、54.09%、67.90%。DH、DM、DH+DM处理根体积较CK相比有所增加，较CK相比分别增加29.6%、40.28%、33.98%。根尖数表现为DM>DH>DH+DM>CK，DM较CK相比，根尖数显著(P<0.05)增加128.61%。总体来看，浸根方式DH+DM处理根体积最大，模拟土培DM处理根尖数最多。

表  1  DSE及其代谢物对紫花苜蓿根系构型的影响

Table  1.  Effects of DSE and metabolites on root architecture characteristic of Medicago sativa

培养方式	处理方式	根系长度/cm	平均直径/mm	根体积/mm3	表面积/cm2	投影面积/mm2	根尖数
浸根	CK	55.49±17.43b	2.36±0.27abc	99.87±19.46b	7.65±2.19a	2.43±0.70a	39.27±8.05b
	DH	88.40±9.48ab	2.32±0.15bc	180.78±31.17ab	12.61±2.20a	4.11±0.70a	66.93±11.15ab
	DM	64.60±1.57ab	2.82±0.25ab	181.52±25.98ab	11.42±1.03a	3.63±0.33a	40.90±1.27b
	DH+DM	76.65±20.19ab	2.88±0.12a	231.82±52.43a	13.98±3.49a	4.45±1.11a	72.27±7.6ab
模拟土培	CK	57.22±4.08ab	2.45±0.02abc	111.91±7.85b	9.47±1.00a	3.01±0.32a	38.83±0.53b
	DH	70.55±2.56ab	2.41±0.11abc	144.43±8.56ab	10.58±0.20a	3.37±0.06a	53.20±7.61ab
	DM	88.17±15.15ab	2.18±0.15c	156.99±44.22ab	12.11±2.70a	3.85±0.86a	88.77±30.19a
	DH+DM	96.07±3.62a	2.07±0.11c	149.94±4.51ab	12.48±0.37a	3.97±0.12a	50.83±3.14ab

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图  4  不同处理下紫花苜蓿根系结构

Figure  4.  Root structure of Medicago sativa L. under different treatments

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2.5   DSE及其代谢物对紫花苜蓿养分含量的影响

DSE及其代谢物对紫花苜蓿组织中全氮、全磷、全钾含量的影响如图5所示。接种DH、DM、DH+DM紫花苜蓿的营养元素含量均有所增加。浸根方式DH+DM处理紫花苜蓿全氮含量最高，较CK相比显著(P<0.05)增加82.16%，模拟土培DM处理紫花苜蓿全氮含量最高，较CK相比显著(P<0.05)增加103.70%。模拟土培各处理紫花苜蓿全磷含量均高于浸根方式，其中，DH处理全磷含量显著(P<0.05)高于其他处理，全磷含量较对照增加131.50%(图5b)。浸根方式与模拟土培DH处理紫花苜蓿全钾含量最高，浸根方式DH处理全钾含量较CK显著(P<0.05)增加116.75%，模拟土培DH处理全钾含量较CK显著(P<0.05)增加55.01%(图5c)。

图  5  DSE及其代谢物对紫花苜蓿养分含量的影响

Figure  5.  Effect of DSE and metabolites on the nutrient content of Medicago sativa L.

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2.6   接种方式、接种处理与紫花苜蓿生长指标相关性分析

由图6所示的相关性分析表明，接种处理与菌丝定殖率、微菌核定殖率、总定殖率、根长、根表面积、根投影面积呈显著正相关(P<0.05)，与地上部鲜重、根鲜重、总鲜重、根体积、全氮、全钾呈极显著正相关(P<0.01)。浸根方式接种对菌丝定殖率、总定殖率更有效，对根直径影响显著(P<0.05)，对全磷影响极显著(P<0.01)。说明浸根方式接种DSE及其代谢物对促进紫花苜蓿生长更有效。同时，不同的接种处理对紫花苜蓿生长发育具有不同的作用效果。菌丝定殖率与总定殖率与根体积、全氮、全钾呈显著正相关(P<0.05)，与根鲜重、总鲜重呈极显著正相关(P<0.01)。表明DSE菌丝、DSE代谢物均能促进植物根系发育，促进植物养分积累进而促进植物生长。

图  6  接种方式、接种处理和紫花苜蓿侵染率、生理生长指标相关性热图

注：It—接种处理；Im—接种方式；H_cr—菌丝定殖率；M_cr—微菌核定殖率；C_r—总定殖率；S_b—地上部鲜重；R_b—根鲜重；R_sr—根冠比；T_b—总鲜重；C_a—叶绿素a；C_b—叶绿素b；C_t—总叶绿素；C_xc—类胡萝卜素；R_l—根长；R_d—根直径；R_v—根体积；R_sa—根表面积；P_a—根投影面积；R_t—根尖数；N—全氮；P—全磷；K—全钾；接种方式：固体基质设为1，液体基质设为0；*在0.05水平(双侧)上显著相关；**在0.01水平(双侧)上显著相关；***在0.001水平（双侧）上显著相关。

Figure  6.  Heatmap showing correlation between different planting method, inoculation treatment, physiological, biochemical indexes and infection rate of Medicago sativa L.

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2.7   接种方式和接种处理对紫花苜蓿生长特性的分解分析

对植物生理生长指标进行分解分析，结果表明，接种方式对紫花苜蓿生长的贡献度为3.1%，接种处理对紫花苜蓿生长贡献度为14.0%，两者对紫花苜蓿生长的共同贡献度为−2.4%，未被这2种环境因子解释到的残差为85.3%(图7)。说明2种环境因子完全独立，两2环境因子相比，接种处理是影响紫花苜蓿生长的主要因素。

图  7  接种方式和接种处理对紫花苜蓿生长特性的分解分析

Figure  7.  Variation partition analysis of different inoculation variation method and inoculation treatment

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3.   讨　　论

煤炭开采过程破坏生态，对土壤、植被生长环境造成扰动，矿区生态环境微生物修复技术的应用，是从生态系统功能和结构修复的角度出发进行生态环境修复的一种可持续发展的方法。紫花苜蓿是矿区植被恢复的先锋植物，其长势参数，地上生物量、株高和植被水分可用于评价矿区复垦效果^[32]。研究中添加DSE紫花苜蓿根长、根体积、根表面积、根投影面积以及根尖数增加；增加了植物全氮、全磷、全钾含量，增加了植物总生物量。有研究发现DSE菌丝可以延伸到根皮层细胞、细胞内以及根维管组织内扩大根的吸收面积，有效促进植物对水分和养分的吸收^[33]，DSE微菌核作为重要的贮藏器官可以积累大量糖原、蛋白质、聚磷酸盐和脂质等营养物质^[34]。因此，DSE在紫花苜蓿根内的定殖促进了表明DSE可以促进根系发育，继而扩大根系吸收养分的空间。增加植物对营养元素的吸收，进而促进植物的生长。此外，有研究发现DSE代谢物中氨基酸和肽类占总化合物的36.45%^[21]，氨基酸可能是植物氮营养的重要贡献者^[35]，植物可以直接吸收氨基酸、酰胺、二肽、三肽和寡肽作为氮源，研究中在不同基质添加DSE代谢物紫花苜蓿体内含氮量增加，可能是由于植物吸收了DSE代谢物中的氨基酸和肽类物质，促进了紫花苜蓿的生长。

研究中浸根方式接种DSE紫花苜蓿根内DSE菌丝的定殖率更高，可能是浸根方式可以使菌体富集，能够在根表面看到菌体的缠绕^[36]，说明DSE菌液浸根幼苗可以快速有效的地促进DSE定殖。浸根方式DH+DM处理叶绿素含量更高；DH、DH+DM处理促进根系结构发育以及养分吸收。王淑惠等^[37]发现接种鲜样和风干样DSE均能在紫花苜蓿根内定殖并促进植物生长，这与研究具有相似的结果。因此DSE菌液浸根方式是在西部矿区复垦过程中前期帮助促进幼苗快速生长的有效方式。此外，模拟土培方式接种DSE及其代谢物较对照相比根平均直径更细，这与应益山等^[38]的研究结果相似，根系直径越小，其生理功能可能越活跃，DSE及其代谢物在模拟土培中的添加可能促进了根系吸收水分和养分的活跃程度。相关性分析表明，与接种方式相比，接种处理是影响紫花苜蓿生长的主要因素，无论是浸根方式还是模拟土培方式接种均能够促进紫花苜蓿的生长，这与郑爱珍等^[39]人施用相同微生物菌剂，采用不同接种处理培养番茄均能够促进番茄生长的研究结果一致。

近年来，微生物菌剂因其经济高效、低能耗、不产生二次污染等特点，被广泛应用于矿区生态环境修复领域^[40-42]。研究通过室内模拟试验，分析对比了不同方式接种DSE及其代谢物的有效性，发现浸根方式接种对紫花苜蓿的生长更有益，DSE及其代谢物能够有效促进紫花苜蓿幼苗的生理生长，有潜在的生态修复利用价值。研究主要针对于紫花苜蓿幼苗生长情况，对于紫花苜蓿后期生长和矿区实际环境条件下的(土壤质地、养分、水分、土壤pH等)生长效应有待于进一步观察。

4.   结　　论

1)浸根方式是最有效的接种方式。浸根方式DSE以菌丝为主要定殖结构。浸根方式接种DH+DM处理对紫花苜蓿的促生效果最好，与对照组相比，地上部鲜重、根鲜重、总鲜重、叶绿素b、总叶绿素、根体积、全氮和全钾含量分别显著增加83.53%、84.15%、83.78%、43.19%、35.54%、132.12%、82.16%、111.20%。

2)模拟土培方式DSE以微菌核为主要定殖结构。模拟土培方式DM处理对紫花苜蓿生长的促进作用最明显，较对照相比，地上部鲜重、根鲜重、总鲜重根尖数、全氮含量分别显著提升97.37%、88.77%、94.25%、128.61%、103.70%。

3)相关性分析表明，与接种方式相比，DSE不同接种处理是影响紫花苜蓿营养成分、生长特性的关键因素。DSE与其代谢物均能促进紫花苜蓿生长，对于矿区逆境的抗性具有潜在作用，有菌肥开发的潜力。